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m6A第二彈正在向你襲來,發了19分!

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RNA甲基化是表觀遺傳學領域的研究熱點,也是高分文章的寵兒,目前大熱點有m6A、m5C、m1A RNA甲基化,尤其m6A修飾熱度只增不減,那么,本期我們繼續m6A。這次分享的文章是發表在Nature Cell Biology上的“Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation”,文章是關于造血干細胞(HSC)的研究,也關于m6A,主角分子依舊是Mettl3蛋白。

本文所有圖片及數據均來源于:Lee, H., et al. "Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation." Nature cell biology (2019).

 

研究背景:造血干細胞(HSCs)維持平衡的自我更新和分化,但這些功能如何被精確調節尚不完全清楚。m6A mRNA甲基化已成為影響許多生物過程轉錄基因表達調控的重要模式。基于這些,作者開展了實驗。利用Lysm-cre轉基因技術小鼠Mettl3條件敲除后,髓系細胞的數量和功能并未被影響HSCs分化受阻Myc的轉錄本是m6A最主要修飾靶基因HSC細胞進行MeRIP-seq,發現,Mettl3缺失的HSC細胞中,MYC的表達量下降,挽救實驗中增加分化刺激因素或者人為上調表達MYC基因,都可以使得挽救HSC的分化功能缺陷。

研究結果:

1、Mettl3蛋白敲除后HSC細胞大量堆積

根據已有研究報道,HSCs可以直接產生血小板,通過腹膜注射pIpC到敲除Mettl3Mx1-cre中,通過全血細胞計數分析顯示Mx1-cre中血小板計數顯著降低;Mettl3fl/fl小鼠與pIpC處理的對照相比,白細胞計數也顯著降低且分布改變,這表明m6A與造血功能相關;pIpC最后一次注射,10天時,Mettl3的缺失導致髓系細胞的數量顯著減少,脾細胞無變化;注射后2-4個月,除髓系細胞的數量顯著減少之外,脾臟大小及細胞構成反而增加;在骨髓中,LSK和HSCs在檢測的時間點都有增加,且HSCs在最后一次pIpC注射后10-14天到4個月持續增加,而LSK只是略有增加;另外,觀察到Lin-Scal-cKit+CD150+CD41巨核細胞和CD41巨核細胞與對照相比顯著增加。所有相關數據表明Mettl3的喪失導致HSC細胞堆積,并且影響巨核細胞譜系

 

2、Mettl3蛋白缺失阻礙HSCs正常分化

BrdU注射Mx1-cre鼠,檢測細胞周期、細胞死亡等指標,結果發現:Mettl3fl/fl小鼠與對照相比,BrdU摻入并沒有大的差異,但是細胞死亡顯著增加;另外,使用5-氟尿嘧啶處理pIpC注射的Mx1-cre小鼠時,Mettl3fl/fl小鼠的存活率低于對照組;這說明HSCs的積累可能是分化受阻而非自我更新增強。而后作者進一步利用甲基纖維素檢測HSCs的分化能力,與對照相比,喪失Mettl3的HSCs形成集落更少且菌落更小,作者利用流式細胞術分析,發現這些細胞是不能分化的;但是,當Mettl3缺陷的髓系細胞接種到甲基纖維素中時,與對照相比,形成的集落在數量,大小和類型上相似,且這些菌落含有正常數量的分化細胞。這表明Mettl3的缺失導致HSCs的分化受阻,但在體外限制性祖細胞中不存在此現象。

 

3、Mettl3是HSCs分化過程的必需分子

為了測試Mettl3的缺失是否導致體內HSCs缺陷,作者通過利用Mx1-cre500,000個髓細胞進行競爭性重組測定。 發現HSCs水平有降低趨勢;作者將Mettl3缺陷型和對照HSCs以及野生型競爭性髓系細胞分選出來,并移植到致死量照射的小鼠中,移植對照HSCs的受體鼠能夠重組主要造血譜系,但缺乏Mettl3的HSCs不能重組缺陷主要發生在骨髓和B譜系中,且缺乏Mettl3的HSCs在自我更新上基本是正常的,但是隨著分化層次推移,所分化的造血細胞逐漸減少;這表明Mettl3缺陷型HSCs在造血重組方面存在缺陷,且Mettl3是HSCs分化過程的所必需的。

 

4、骨髓細胞生成不需要Mettl3

作者在Lysm-cre中敲掉Mettl3蛋白,6-8周齡的鼠各細胞參數正常(外周血、骨髓、脾細胞等參數),且都可以形成正常形態的巨噬細胞;當受到脂多糖攻擊時,顯示出的炎性細胞因子Tnfa,Il1b和Il6均正常上調;Mettl3缺陷型骨髓細胞也顯示出強烈的吞噬活性,這個現象與對照相似;這說明Mettl3不是成熟骨髓細胞維持功能所必需的,HSCs在體內造血分化期間對Mettl3和m6A的階段特異依賴。

 

5、鑒定HSC中與m6A作用的靶基因

利用MeRIP-seq技術鑒定,發現在對照小鼠中,富集了2073個轉錄產物,而在Mettl3缺陷型HSCs的Mx1-cre中,經過pIpC處理10天,只富集了995個轉錄產物,與對照相比,顯著降低;這說明m6A修飾與Mettl3蛋白的表達密切相關。此外,Myc, Junb 和 Tet2被認為是m6A修飾的主要靶基因,Mettl3缺陷型HSCs中,這些基因的表達量也下調

 

6、Mettl3介導的m6A會改變HSCs特性

作者在Mettl3缺陷型HSCs中找到384個上調基因,其中95個是m6A靶標,將基因分為m6A靶基因和非m6A靶基因,通過MeRIP-seq,發現m6A靶標相比,m6A靶標的轉錄物在Mettl3缺陷型HSC中具有略微增加的豐度,根據已有研究報導,HSC中MYC蛋白水平非常低在通過轉錄機制進行分化后被上調MYC的缺失阻斷HSCs分化,而更高水平的MYC蛋白可以促進HSCs分化,這個現象與Mettl3缺陷型HSCs的表型相似,因此,作者進一步通過MeRIP-seq技術檢測,發現Mettl3缺陷型HSCsMYC轉錄物水平沒有顯著變化,但是,GSEA基因富集分析結果發現Mettl3缺陷型HSCsMyc-靶基因特征的顯著降低表明m6A可能主要調節Myc mRNA翻譯,進一步在MYC蛋白中插入GFP蛋白,用來檢測MYC蛋白表達量,結果:Mettl3的缺失導致HSCsMYC-GFP的表達顯著降低,在激活HSCs分化后,對照HSCs的MYC-GFP表達上調,而Mettl3缺失型HSCs的MYC-GFP表達不能上調,這說明m6A是HSC中Myc mRNA翻譯所必需的,特別是在分化后。并且Myc強制表達可以挽救由Mettl3缺失引起的HSCs分化缺陷。

 

文章總結:利用Lysm-cre轉基因技術小鼠Mettl3條件敲除后,髓系細胞的數量和功能并未被影響,但HSCs分化受阻;Myc的轉錄本是m6A最主要修飾靶基因HSC細胞進行MeRIP-seq,發現,Mettl3缺失的HSC細胞中,MYC的表達量下降,挽救實驗中增加分化刺激因素或者人為上調表達MYC基因,都可以使得挽救HSCs的分化功能缺陷Mettl3所介導的m6A是HSCs分化過程中所必須的。

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